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    野百合碱处理大鼠肺动脉高压模型的塑造
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    野百合碱处理大鼠肺动脉高压模型的塑造

    作者:王毅 林伟 施举红    作者单位:325000 浙江省温州市第三人民医院(王毅 林伟)100000 中国医学科学院北京协和医院(施举红) 

    【关键词】  野百合

    基金项目温州市科委基金资助(Y2006A010)

    肺动脉高压尤其是特发性肺动脉高压(Idiopathic Pulmonary Artery Hypertension,IPAH)是一种预后极差的疾病,其发病机制不明,治疗棘手。野百合碱(Monocrotatine,MCT)属于豆科植物野百合属,它所引起的肺动脉高压(Pulmonary Artery Hypertension,PAH)大鼠是一种较为理想的肺动脉高压动物模型[1,2],在MCT-PAH动物模型大鼠血清中已发现内皮素-1ET-1)、心钠素(ANP)及血栓素2TXB2)明显升高,而环鸟苷酸(CGMP)、降钙素基因相关肽(CGRP)6--前列腺素(6-keto-PGF1a)明显下降[3]。但不清楚这些炎症介质的改变是PAH发病的起始原因,抑或是PAH的结果。作者观察MCT所致PAH大鼠血清对肺动脉压力、肺血管重塑的影响,以了解炎症机制在PAH发病过程中的作用。

      1  材料与方法

      1.1  实验动物与MCT溶液配制 

      雄性Wister SD大鼠140只,体重150180g,由中国医学科学院北京协和医院实验动物中心提供;MCT结晶(美国产溶解在0.5N盐酸(HCL)溶液,用0.5N碳酸氢钠(NaHCO3)调整pH7.4的溶液。

      1.2  MCT肺动脉高压动物模型建立 

      MCT注射大鼠(单剂腹腔注射60mg/kg-120只为MCT-PAH动物模型组(MCT组),以相同剂量等张生理盐水以相同方法注射正常大鼠10只为对照组(IS组);两组大鼠正常饲养,每隔7d取各组大鼠1只处死,行大体病理观察,且取血标本及肺组织保存;对照组在第28天(IS28),试验组在第28天(MCT28)、第42天(MCT42)各取大鼠5只行右心导管检查及肺动脉病理观察。

      1.3  对照组用大鼠血浆(DB)和试验组用大鼠血清(SB)制备。

      DB制备:取成年雄性Wistar SD级大鼠20只,体重150180g。在每只大鼠的尾静脉处切一约1mm的切口,同时滴入肝素钠和生盐水(12)溶液0.20.5ml, 取血0.51.0ml, 分别取20只大鼠尾静脉血20 mlSB制备:取成年雄性Wistar SD级大鼠20只,体重150180g。一次性腹腔注射MCT 60mg/kg-1。饲养至14d,分别取20只大鼠尾静脉血20ml。取得肝素抗凝大鼠血后,立刻以15002000r/min离心1520min后取上清液,储藏-70℃冰柜保存。

      1.4  实验与分组 

      将实验大鼠分为对照组(D组)35只,试验组(S组)35只。S组从大鼠阴茎静脉注入SB的血浆液,D组用同样剂量同样方法注入DB的血浆液。两组大鼠分别做好标志,饲养到第7天后每隔24d每组处死大鼠1,做大体病理观察,17225360天,每组取5只大鼠进行肺动脉血流动力学测定后,处死实验大鼠,取双侧肺组织,10%甲醛液固定保存。
      
      1.5  观察指标 

      右心导管检查:将乌拉坦(北京产)配制成12%浓度,称取大鼠体重,以1.0ml/kg腹腔内注射,麻醉后分离右侧颈内静脉,置入微导管(北京协和医院提供),连接Gould(美国产)心电监护仪,缓慢推送导管至右心房、右心室、肺动脉,出现典型稳定的压力曲线波时,记录右心室压(RVP)、肺动脉收缩压(PAP)及压力曲线。纸速为5mm/s,计算平均肺动脉压(mPAP)。肺动脉病理标本制作:切开大鼠左侧胸腔,取左侧肺组织,切除其上附着的纵隔组织后置入10%甲醛液固定,肺门横断取材、石蜡包埋,制片,HE染色。

      1.6  统计学处理 

      各项数据以(x±s)表示,采用SPSS 12.0统计软件进行单因素方差分析及q检验。

      2  结果

        MCT处理大鼠肺动脉压力(表1)及病理改变。对照组大鼠在整个试验期全部生存(10只),而MCT处理大鼠试验过程死亡4只。大体病理:对照组大鼠肺组织呈淡红色,未见出血点、瘀点、瘀斑;单剂注射MCT大鼠在MCT71421283542天肺组织表现变苍白,均见不同程度的瘀点瘀斑,随时间延长更趋明显。试验组SB79肺表面基本正常,SB12141719212327两侧肺表面变白均可见点状出血灶、瘀斑,右肺中、后叶明显。光镜检查:观察对照组肺动脉血管,内皮细胞扁平连续,细胞分布均匀,大小厚薄较一致。试验组肺动脉内膜增生,中层增厚(图12),并随时间的延长日趋严重(图34),SB60动脉中膜厚度比例已达正常对照组的两倍之多(图5)。电镜检查:对照组正常肺动脉内皮细胞扁平紧紧地粘附在基底膜上,细胞的游离面出现微绂毛突起。试验组SB17肺动脉壁增厚,平滑肌增生,平滑肌细胞核固缩(图6);SB22平滑肌细胞增宽,胶原纤维增生(图7);SB53内皮细胞基底部变窄,向血管腔内突出,部分核固缩,空泡拱桥样改变(图8);SB60弹力板粗不匀,内皮细胞空泡形成,血管壁增厚(图9)。两组肺动脉血流动力学检测结果见表2。表1  MCT处理大鼠肺血流动力学与右心肥大指数的变化()2  试验组与对照组肺动脉平均压与右室压的比较(略)

      3  讨论    
      MCT被肝脏激活为亲电子的MCT,引起肺血管内皮损伤及后续的肺血管重塑[4]。MCT可重复诱导严重的进展性肺动脉高压在本研究中被证实,肺动脉压力几乎增加了3倍,同时观察到右室肥厚和大鼠体重的下降,光镜下观察到肺血管重塑明显,表现为内膜增生中层增厚及机化。并且MCT单剂注射后有4只大鼠完成试验前因严重右心衰竭死亡。对MCT-PAH模型和PAH患者研究发现,许多炎症因子与肺动脉收缩、细胞增殖、微血栓形成有着密切的相关性[5]。目前较公认炎症因子有:TXA2PGI2NO(一氧化氮)、ET-1 5-HT5-羟色胺)、VIP(肠道血管活性肽)、VEGF(血管内皮生长因子)及肾上腺髓质素。但上述炎症因子与肺动脉高压发病相关研究的对象往往是MCT-PAH动物模型。MCT诱导大鼠的PAH机制是MCT直接对肺动脉毒性作用抑或后继炎症反应的综合作用,故仍不清楚炎症因子的改变是肺动脉高压的标志抑或病因。也不能证实炎症因子可直接导致PAH。    早在1991Estep JE等[6]用[14C]标记MCT研究MCT 60mg/kg-1腹腔内注射24h时组织分布,红细胞、肝脏、肾脏、肺脏及血浆组织MCT水平分别为49259102 nmol/g-1,认为红细胞作为MCT代谢产物的载体将毒性的MCT产物从肝脏运输到肺,产生肺组织毒性作用。本研究利用MCT处理大鼠14d后的血清作为炎症因子复合体,可以排除MCT的直接毒副作用对肺血管的损害,以观察炎症因子是否可能引起肺血管的重构。与正常大鼠的血浆液(DB组)对照,发现SB17已出现肺动脉内膜增生、中层增厚、腺泡小动脉的机化,这种病理改变并且在SB225360更趋明显。提示炎症因子的复合液可以直接引起肺动脉内皮细胞损害及血管的重塑。SB17225360MPAPRVPDB组相比,虽有上升趋势,但两组差异无显著性,说明肺动脉压力的升高比MCT-PAH大鼠缓慢些。
           
      本研究首次证实了MCT处理的血浆可以引起肺血管的重塑,提示炎症因子在特发性肺动脉高发病机制中可能起着重要的作用,哪些炎症因子可引起肺动脉高压应做深入的研究。

    【参考文献】
        曾志羽,黄海,李醒三.非洛地平对野百合碱所致大鼠肺动脉高压的作用.中华结核和呼吸杂志,200225(8):461464.
      陈瑞芬,周光德,曹文军,.野百合碱诱导实验性肺动脉高压病理形态观察.电子显微学报,200221(1):14.
      孙燕妮,刘忠令.野百合碱诱发肺动脉高压大鼠血管活性物质的变化.中国药理学通报,200117(5):573573.
      4 Pan LC, Lame MW, Morin D,et al. Red blood cells augment transport of reactive metabolites of monocrotaline from liver to lung in isolated and tandem liver and lung preparations. Toxicol Appl Pharmacol, 1991110(2):336346. 
      5 Harrison W, Joseph Loscalz. Pulmonary Arterial Hypertension. NJEM,2004351:16551665. 
      6 Estep JE, Lame MW, Morin D,et al. 14Cmonocrotaline kinetics and metabolism in the rat. Drug Metab Dispos, 199119(1):135139.

     

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